Veel aanvragen voor genetisch onderzoek naar erfelijke hemolyse

Richard van Wijk is hoofd rode bloedceldiagnostiek en onderzoek in het UMC Utrecht. Hij combineert diagnostiek en onderzoek bij o.a. zeldzame erfelijke vormen van hemolytische anemie, waaronder hereditaire sferocytose.

Wat onderzoek je precies?

We doen onderzoek naar de diverse vormen van erfelijke anemie. We bestuderen de effecten van deze aandoeningen op de structuur en het functioneren van rode bloedcellen. Tevens zijn we een nationaal en internationaal erkend expertisecentrum op het gebied van de laboratoriumdiagnostiek.

Welke diagnostische middelen gebruiken jullie?

De standaard screening voor hereditaire sferocytose bestaat uit drie belangrijke testen: allereerst de Lorrca-osmoscan (osmotische gradiënt ektacytometrie). Een tweede belangrijke test die speciaal wordt gebruikt voor sferocytose is de EMA-kleuring. De derde test is de klassieke osmotische fragiliteitstest. Een heel oude test die nog steeds voordelen heeft en goed bruikbaar is. De osmoscan wordt uitgevoerd met de Lorrca (laser optical rotational red cell analyzer), een apparaat waarmee we heel nauwkeurig verschillende aspecten van de vervormbaarheid van de rode bloedcellen kunnen meten. De rode bloedcel moet heel goed vervormbaar zijn om door te kunnen dringen tot in de kleinste bloedvaatjes in het lichaam om daar zuurstof af te geven. Bij sferocytose is door een genetisch bepaalde oorzaak de cel minder vervormbaar. Dat heeft te maken met een sterk verhoogde mate van membraanverlies waardoor de rode bloedcel ‘te strak in zijn jasje zit’ en waardoor de vervormbaarheid van de cel sterk verminderd is. Die vervormbaarheid kunnen we heel goed meten met de osmoscan op de Lorrca.

Hoe meet je die vervormbaarheid?

Het principe berust op osmose. Bij osmose stroomt het water van een gebied met een lage concentratie opgeloste stoffen naar een gebied met een hoge concentratie opgeloste stoffen. We meten bij verschillende osmolaire waarden buiten de cel. Rode bloedcellen in een hypo-osmolaire omgeving (lage concentratie opgeloste stoffen) nemen via osmose water op waardoor die cellen opzwellen, wat een negatief gevolg heeft op de vervormbaarheid. In een hyperosmolaire omgeving (hoge concentratie opgeloste stoffen) gebeurt het omgekeerde en verliest de rode bloedcel juist water. En een cel die uitgedroogd is, is ook minder goed vervormbaar.

Hoe werkt de osmoscan in de praktijk?

Met de Lorrca-osmoscan volgen we het verloop van een heel lage naar een heel hoge osmotische waarde. Je ziet dan eerst een toename en daarna weer een afname van de vervormbaarheid van de rode bloedcel, zodat er een karakteristiek vervormbaarheidspatroon in de vorm van een curve ontstaat. De vervormbaarheid is optimaal bij een osmolaire waarde gelijk aan die van plasma. Bij sferocytose zijn de cellen kleiner dan normaal en kunnen de rode bloedcellen al minder water opnemen dan normale cellen. Dat verschil in opnamecapaciteit zie je terug in de curve. Wanneer je bloed van een hereditaire sferocytosepatiënt in het apparaat stopt, krijg je een andere curve dan bij een gezond persoon. Je ziet dus een heel duidelijk veranderd vervormbaarheidspatroon. Dat wil niet zeggen dat elke hereditaire sferocytose er hetzelfde uitziet, daar zitten ook weer verschillen in, maar er zijn wel een paar algemene kenmerken. De osmotische gradiënt ektacytometrie (osmoscan) op de Lorrca wordt momenteel beschouwd als de gouden standaard in de diagnostiek van membraanstoornissen zoals hereditaire sferocytose.

Kun je met deze test nog andere ziektes aantonen?

Ja, we kunnen ook andere membraanstoornissen aantonen, zoals hereditaire elliptocytose, en hydratatiestoornissen. De hydratatie (opname van water) van de rode bloedcel wordt gereguleerd door allerlei (ion)kanalen in de celmembraan. Afwijkingen daaraan kun je ook zien met behulp van deze techniek. En het is zelfs mogelijk om allerlei andere ziekten van de rode bloedcel, zoals bijvoorbeeld thalassemie, aan te tonen. Al deze aandoeningen hebben een karakteristiek afwijkende vervormbaarheid van de rode bloedcel met een eigen karakteristieke curve. De Lorrca-osmoscan is een van de weinige testen die het onderscheid kan maken tussen heel veel verschillende rode bloedcelaandoeningen.

Hoe werkt de EMA-kleuring?

De EMA-kleuring is een test die specifiek voor sferocytose wordt gebruikt. EMA (eosine-5-maleimide) is een fluorescerend stofje dat zich bindt aan de eiwitten die aan de buitenkant van de rode bloedcelmembraan zitten. Bij sferocytose is de hoeveelheid membraan van de rode bloedcel verminderd waardoor er minder EMA aan de buitenkant van de rode bloedcelmembraan kan binden. Je krijgt dan een verminderde EMA-kleuring en dat meet je met behulp van de FACS (fluorescence-activated cell sorting) oftewel flowcytometrie. De EMA-kleuring kun je gebruiken om een verdenking van hereditaire sferocytose die met de osmoscan is vastgesteld, te bevestigen. De EMA-kleuring is een veelgebruikte, vrij goedkope test, maar het kost wel meer tijd dan bijvoorbeeld de Lorrca-osmoscan.

Wat is de osmotische fragiliteitstest?

Deze test wordt uitgevoerd in buisjes met verschillende zoutconcentraties. De test werkt min of meer volgens hetzelfde principe als de Lorrca-osmoscan. Bij lage zoutconcentraties zwellen de rode bloedcellen op en lyseren ze (ze barsten). Bij hereditaire sferocytose gebeurt dat sneller dan bij gezonde rode bloedcellen. Een voordeel is dat deze test beter subpopulaties zichtbaar maken dan de Lorrca-osmoscan. Bij sferocytose zijn bepaalde populaties rode bloedcellen vaak extra fragiel (breekbaar). Met behulp van de fragiliteitstest zie je dat een bepaald klein deel van de curve buiten het normale gebied valt. Als een subpopulatie cellen extra fragiel is, is dat een extra aanwijzing voor sferocytose, en dat is dus een toegevoegde waarde van deze test.

Waarom wordt de Lorrca-osmoscan niet overal gebruikt?

De Lorrca is een duur apparaat, dus er moet wel voldoende aanbod van bloedmonsters zijn om het rendabel te maken. Hereditaire sferocytose is tenslotte een zeldzame vorm van hemolytische anemie. Daarom is de Lorrca vaker in academische ziekenhuizen te vinden dan in een regionaal ziekenhuis.

Doen jullie eigenlijk nog standaard bloedonderzoek, bijvoorbeeld een bloeduitstrijkje?

Uiteraard is het heel belangrijk om naar rode bloedcellen te kijken, daar kun je toch veel uit afleiden. De naamgeving van de verschillende membraanstoornissen is ook gebaseerd op de specifieke vormveranderingen die ze op een bloeduitstrijkje laten zien. Als je bijvoorbeeld een bloeduitstrijkje van een patiënt met elliptocytose onder de microscoop bekijkt, zie je meteen dat het om elliptocytose gaat. Daar heb je in principe geen duur apparaat als de Lorrca voor nodig. De beoordeling van het rode bloedbeeld gebeurt tegenwoordig steeds vaker met behulp van de digitale microscopie. Voor diagnostiek van patiënten van buiten het UMC Utrecht (80% van ons aanbod) is de kwaliteit van het ingezonden bloed niet meer zo geschikt om zo’n bloeduitstrijkje te maken. Soms wordt er door aanvragers een lokaal gemaakt preparaat meegestuurd.

Jullie doen ook nog genetische diagnostiek. Wanneer wordt die toegepast?

We krijgen veel aanvragen, een stuk of honderd per jaar, voor verschillende vormen van erfelijke hemolyse. Het aandeel hereditaire sferocytose ligt naar schatting zo rond de 30%. Genetisch onderzoek wordt vaak aangevraagd in combinatie met functionele diagnostiek zoals de Lorrca-osmoscan. Omdat het om zeldzame aandoeningen gaat, kan genetische diagnostiek een aanvulling zijn op de voorlopige diagnose. Met de uitkomst van dat onderzoek leg je de diagnose definitief vast.

Kun je een voorbeeld geven waarbij genetische diagnostiek nodig is?

Auto-immuun hemolytische anemie lijkt in veel opzichten erg op hereditaire sferocytose. Genetische diagnostiek biedt dan uitkomst. Maar het is vooral behulpzaam bij patiënten die donorbloed hebben gehad waardoor biochemische diagnostiek op dat moment niet mogelijk is. Je ziet daarnaast bijvoorbeeld ook dat binnen families met hereditaire sferocytose de ernst van de klachten sterk kan wisselen. Ik herinner mij een familie van drie generaties met ernstig aangedane patiënten, maar er was ook een kind van zes jaar met symptomen van hemolytische anemie dat nog nooit een transfusie had gehad. Soms is het daarom moeilijk om een diagnose binnen een familie te stellen, ook dan kan genetische diagnostiek behulpzaam zijn. Belangrijk is ook te weten dat hereditaire sferocytose in 75% van de gevallen een dominante aandoening is, dat betekent dat meestal dan ook een van de ouders is aangedaan. Die informatie helpt bij het stellen van de diagnose. In 25% gaat het echter om recessieve vormen. In die gevallen zijn ouders niet aangedaan en dan is DNA-diagnostiek extra belangrijk.

Geven jullie ook genetisch advies aan families?

Nee, dit gebeurt meestal door een arts die veel weet van erfelijkheid, een klinisch geneticus, maar de behandelend arts zelf kan de genetica wel uitleggen en genetische testen aanvragen. Dit gebeurt bijvoorbeeld als er een onbegrepen beeld van hemolyse is, als er geen duidelijke familiegeschiedenis is, of als er sprake is van een ernstig fenotype, d.w.z. dat iemand erg veel last heeft van de ziekte. Als je de genetische achtergrond kent van de familie, kan genetische diagnostiek plaatsvinden. Soms is het bij zeer ernstige vormen nodig om al voor de geboorte een diagnose te stellen omdat al voor de geboorte een ernstige anemie kan ontstaan.

Is genetische diagnostiek bij pasgeborenen altijd nodig?

Bij pasgeborenen werd lang gedacht dat genetische diagnostiek de enige manier was om de diagnose erfelijke sferocytose te stellen, maar door nieuwe technieken is dat niet meer altijd nodig. De ontwikkeling van de rode bloedcel (erytropoëse) bij pasgeboren kinderen is sterk afwijkend ten opzichte van die op latere leeftijd (ouder dan een jaar ongeveer), en ook het bloedbeeld van de rode bloedcel is afwijkend bij pasgeborenen. Het is dus heel lastig om daar in diagnostische zin iets over te zeggen. Om deze reden werd bijvoorbeeld de genetische diagnostiek gebruikt. Maar wij weten inmiddels dat we met de Lorrca-osmoscan ook bij een kind van een paar dagen oud de diagnose hereditaire sferocytose vrij zeker kunnen stellen. Omdat de Lorrca-osmoscantechniek bij pasgeboren echter nog niet gevalideerd is, moeten we voorzichtig zijn. De routinetesten zijn vanaf de leeftijd van zes maanden toenemend betrouwbaar. Wil de arts de diagnose heel zeker weten, dan kiest deze voor DNA-diagnostiek.

Is er meer vraag naar genetische diagnostiek?

Tot ongeveer tien jaar geleden was genetische diagnostiek bijna onmogelijk omdat we de huidige analysetechnieken niet hadden. En het was extreem arbeidsintensief en tijdrovend. Maar de opkomst van de next generation sequencingtechnieken, een nieuwe manier van DNA-sequentie bepalen, heeft genetische diagnostiek van meerdere genen per keer in heel korte tijd mogelijk gemaakt en tegen relatief lagere kosten. Dit heeft ertoe geleid dat artsen vaker genetisch onderzoek aanvragen wanneer zij inschatten dat dit nodig is voor de juiste diagnose of een gerichter behandeladvies.

Hoe werk zo’n genetisch onderzoek?

Er zijn op dit moment 46 genen bekend die geassocieerd zijn met erfelijke hemolytische anemie. Deze 46 genen zijn nu opgenomen in een zgn. genpanel, en bij genetisch onderzoek gaan we op zoek naar de ziekte veroorzakende veranderingen (mutaties) in die genen. Het kan zijn dat er geen verklaring wordt gevonden met dit genpanel. Dan kunnen we ook nog naar een researchpanel van tachtig andere genen kijken. Die genen zitten in dat panel op basis van hun functie in de rode bloedcel of van experimenten in diermodellen. Als we er met de standaard genen niet uitkomen, kunnen we na toestemming van de patiënt en de behandelaar het DNA van de patiënt ook daarvoor gebruiken. In uitzonderingsgevallen gaan we ‘op zoek’ naar een verklaring door heel breed te screenen. Af en toe vinden we zo zelfs een nieuw gen dat in verband staat met erfelijke hemolytische anemie. Zo verruimen we ons inzicht in hereditaire sferocytose en andere erfelijke hemolytische anemieën.

Heeft zo’n diagnose consequenties voor eventuele verzekeringen?

Dat is mogelijk, ik ben ook niet altijd voorstander van genetische diagnostiek. Als je bij een patiënt een heel duidelijk afwijkend vervormbaarheidspatroon ziet dat past bij hereditaire sferocytose, als er sprake is van verlaagde osmotische fragiliteit naast een positieve familiegeschiedenis, dan hoef je geen genetisch onderzoek te doen. Maar niet elke hereditaire sferocytose gedraagt zich karakteristiek. Er zijn variaties. Soms is er twijfel en dan is genetische diagnostiek wel degelijk behulpzaam. Andere vormen van erfelijke anemieën zijn vaak zo zeldzaam, dan ontkom je niet aan genetische diagnostiek.

Zie je nog andere toepassingsmogelijkheden van genetische onderzoek in de toekomst?

Hoe meer patiënten we genetisch in kaart hebben, met de functionele testen erbij, hoe meer we weten over de relatie tussen het genotype (erfelijke informatie) en het fenotype (soort en ernst van de klachten). In een later stadium kunnen we zo misschien voorspellen hoe de ziekte zich bij een patiënt gaat ontwikkelen. Is het bijvoorbeeld nodig om bij de ene patiënt de milt eruit te halen en bij de andere niet. Dat kan een verrijking zijn voor zowel de patiënt als de behandelaar.